金文標1， 王寶貞1， 宋莉暉2?
( 1.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，黑龍江哈爾濱150090；2.中國石油勘探開發研究院廊坊分院，河北廊坊065007)

　　摘 要：用常規功能菌篩選和誘變方法獲得了5株高效降解原油菌，通過試驗確定其適宜降解條件：廢水初始pH值為5.5～7.0、溫度為25～35℃、溶解氧為5.5～7.0mg/L。將此菌接種到三相流化床中，在適宜降解條件下可使廢水中的油含量從44.4mg/L降至4.0mg/L，平均去除率為91.0%。?
　　關鍵詞： 原油廢水；三相流化床；篩選；誘變?
　　中圖分類號：X703.1
　　文獻標識碼：C
　　文章編號：1000-4602(2002)03-0051-03

1 菌株篩選

1.1 篩選方法
　　高效降解原油菌遵循一般功能菌篩選的基本原則^［1］，但培養基組成、菌株處理方式、菌種性能測定方法、菌投加量等技術問題需要通過試驗確定。?
　　① 采集菌樣
　　由于篩選出的高效降解原油菌將用于含油廢水處理，故采集的含菌樣品為油污土壤和含油廢水。
　　② 富集培養
　　采用的富集培養基成分為：K₂HPO₄·3H₂O為1g/L、KH₂PO₄·3H₂O為1g/L、Na₂HPO₂·3H₂O為1g/L、NaCl為0.5g/L、MgSO₄·7H₂O為0.05g/L、原油為10g/L。
　　③ 純種分離
　　通過純種分離，可把退化菌種的細胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細胞分離出來，經過擴大培養就可恢復菌株的典型性狀。采用較粗放的平板分離方法能達到“菌落純”的水平。平板培養基組成：牛肉膏為3g/L、蛋白胨為10g/L、NaCl為5g/L瓊脂為15g/L、pH為7.0。分離后需通過顯微鏡觀察并作純種驗證。
　　④ 性能測定
　　分離后獲得純種是篩選工作的第一步，要想得到較為理想的生產和科研用菌，還需進行一系列的測試、比較，篩選出性能穩定、適應范圍寬、符合生產要求的高效菌株。
1.2 篩選結果
　　將純種分離獲得的40株降解原油菌分別接種到40份含油廢水(含有營養物質)中于30℃下搖動培養。
　　因為菌體是不透光的，液體中細菌數量與吸光度成正比，因此在比濁測定中菌株的吸光度大，說明其繁殖得好，即利用原油的能力強，故被認為是相對高效的降解原油菌。經初篩，獲得10株相對高效的降解原油菌株(見表1)。
　　將初篩獲得的10株相對高效降解原油菌經增殖培養后分離出菌泥，分別接種到含原油廢水中(含營養物)，搖動處理12h，靜置沉淀并測定上清液的油含量(用石油醚做萃取劑，采用紫外分光光度法)。除油率結果列于表2。
　　通過對菌株降解原油性能的測定，確定了4株高效降解原油菌：3、9、12、14。

表1 原油降解菌生長狀況測定結果 菌株編號 吸光度 相對高效菌 菌株編號 吸光度 相對高效菌 第一組 第二組 第一組 第二組 1 0.089 0.088 21 0.098 0.078 2 0.050 0.076 22 0.086 0.056 3 0.169 0.179 + 23 0.068 0.050 4 0.109 0.099 24 0.070 0.061 5 0.086 0.076 25 0.198 0.176 + 6 0.085 0.060 26 0.056 0.066 7 0.100 0.098 27 0.096 0.100 8 0.099 0.071 28 0.056 0.062 9 0.148 0.167 + 29 0.050 0.056 10 0.099 0.101 30 0.105 0.099 11 0.059 0.088 31 0.110 0.130 + 12 0.125 0.134 + 32 0.059 0.100 13 0.137 0.148 + 33 0.061 0.077 14 0.122 0.121 + 34 0.098 0.089 15 0.145 0.164 + 35 0.070 0.064 16 0.096 0.100 36 0.061 0.065 17 0.097 0.087 37 0.199 0.176 + 18 0.078 0.056 38 0.102 0.098 19 0.056 0.076 39 0.110 0.131 + 20 0.055 0.050 40 0.091 0.078 注：對照試驗的第一組吸光度值為0.050，第二組吸光度值為0.049。

表2 原油降解菌除油性能測定結果 菌株編號 第一組 第二組 殘油量(mg/L) 除油率(%) 殘油量(mg/L) 除油率(%) 3 3.05 83.4 3.12 83.1 9 2.94 84.0 3.00 83.7 12 3.56 80.7 3.47 81.2 13 7.10 61.5 6.90 62.5 14 5.44 70.5 4.31 76.6 15 9.51 48.4 9.09 50.7 25 8.04 56.4 8.45 54.1 31 10.02 45.6 9.86 46.5 37 5.97 67.6 5.80 68.5 39 9.94 46.0 10.12 45.1 對照 18.42 19.01

2 　菌株誘變

2.1 誘變方法
　　為進一步提高細菌降解原油的性能，對篩選出的4株菌以硫酸二乙酯為誘變劑進行常規誘變。
2.2 　誘變結果
　　試驗獲得了6株誘變菌，誘變前后細菌的除油性能對比結果見表3。

表3 誘變前后細菌除油性能比較 菌株編號 第一組 第二組 殘油量(mg/L) 除油率(%) 殘油量(mg/L) 除油率(%) 3 3.15 84.3 3.23 　85.4 3y1 4.15 79.4 5.03 77.2 3y2 3.01 85.0 3.19 85.6 9 3.04 84.5 3.12 85.9 9y1 3.00 85.1 3.04 86.2 9y2 3.28 83.7 3.45 84.4 12 3.78 81.2 3.90 82.4 12y 3.66 81.8 3.71 83.2 14 4.54 77.4 4.31 80.5 14y 3.02 85.0 3.09 86.0

對照

20.12 22.10

　　通過原菌和誘變菌的除油性能對比試驗，獲得了5株高效降解原油菌，分別是：3、3y2、9、9y1、14y。?
　　對這5株高效降解原油菌進行初步分類鑒定，結果見表4。

表4 初步鑒定結果 菌株編號 菌落顏色 顯微鏡觀察 初步鑒定結果 3 清白色 桿狀 芽孢桿菌屬 3y2 淺黃色 長粗桿狀 芽孢桿菌屬 9 黃白色 短桿狀 黃桿菌屬 9y1 黃色 短桿狀 黃桿菌屬 14y 乳白色 球狀 假單胞菌屬

3 　處理效果及影響因素

3.1 試驗方法
　　將經篩選、誘變獲得的5株菌分別接種于牛肉膏—蛋白胨培養基，培養后離心分離獲得菌泥，將菌泥按相同比例混合后投入含原油廢水中，采用搖動培養，考察pH值、溶解氧、溫度等因素對處理效果的影響。?
　　測定pH值用玻璃電極法，測定溶解氧用膜電極法，測定油含量用紫外分光光度法^［2］。?
3.2 結果與討論
　　① pH值?
　　當廢水油含量為35.42mg/L、處理溫度為30℃、搖床轉速為200r/min、投菌量為5g(濕重)/L時，在不同pH值下處理12h及24h后發現，pH值為5.5～7.0時能有效地降解廢水中的原油，且隨著處理時間的延長，除油率增大。當處理時間為12h時除油率為42%～57%；當處理時間為24h時除油率達70%～78%。當pH＜5.0或＞9.0時除油率迅速降低，這是因為隨著pH值的變化，酶分子上的酸性及堿性氨基酸側鏈基團處于不同的解離狀態，具有催化活性的基團在總酶量中的比例不同使得酶分子的催化能力也不一樣^［3］。H值在5.5～7.0時，總酶量中活性基團的比例大，酶分子的催化能力強，細菌對原油的降解能力也強。?
　　② 溫度?
　　在廢水油含量為35.42mg/L、pH值為6.5、搖床轉速為200r/min、投菌量為5g(濕重)/L的條件下，處理12h及24h后分別測定除油率，結果發現菌的適宜降解溫度為25～35℃。在此范圍內微生物繁殖速率快,24h后除油率可達70%左右，并以30℃時除油效果最佳(除油率達78.5%)。之后再升高溫度，除油率反而略有降低(37℃時測得除油率僅為57.5%)。另外，低溫對原油降解也不利，當溫度為20℃時除油效果明顯下降，這是因為低溫時部分細菌進入內源呼吸期，開始代謝自身細胞內的營養物質，細菌的生長、繁殖速率放緩，導致除油效率下降^［4］。?
　　③ 溶解氧
　　在初始油含量為35.42mg/L、pH值為6.5、環境溫度為30℃、投菌量為5g(濕重)/L時，調節搖床轉速以考察溶解氧量對除油效果的影響(溶解氧與轉速的關系見表5)，結果發現隨溶解氧量的增加原油降解率迅速增加，當DO為6.29mg/L時，除油效率達到80%左右，此后再增大溶解氧量，除油效率增幅不大。這是因為在該試驗條件下菌體能均勻地懸浮于水中，對營養物質的吸收及代謝物的分散都非常有利，氧在生物相間的傳質阻力也可忽略，生化反應控制步驟僅取決于氧在氣—液間的傳質速率。隨著搖床轉速增大，引起水中溶解氧量不斷增加，氣膜和液膜的厚度減小，氣—液相的接觸比表面積增大，氧傳遞阻力減少，氧傳質速率提高，原油降解速率增大；當DO為6.29mg/L時，氧傳質速率與原油降解率相匹配，達到了一個動態的平衡過程。此后，當溶解氧繼續增高時，整個反應過程受菌體自身生長及代謝速率制約，導致總降解速度增加緩慢。

表5 溶解氧與轉速的關系30℃ 轉速(r/min) 0 60 100 100 140 180 260 溶解氧(mg/L) 0.65 3.72 5.10 5.71 5.71 6.29 7.23

4 三相流化床處理含原油廢水

　　三相流化床采用體積質量＞1的細小惰性顆粒活性炭作懸浮填料，采用體積質量＜1的樹脂球作漂浮填料，再接種高效降解原油菌，使其生長于這些載體表面形成生物膜，通過曝氣使廢水自下向上流動，使載體處于流化狀態，其上附著的生物膜可與廢水充分接觸。在溫度為30℃、pH值為6.5、停留時間為2～3h、流量為2～3L/h條件下處理含油廢水，運行穩定后2h取樣分析1次，處理結果見表6。

表6 三相流化床處理效果 樣品編號 流量(L/h) 進口油含量(mg/L) 出口油含量(mg/L) 除油率(%) 1 2.2 42.1 3.7 91.2 2 2.4 42.6 4.5 89.4 3 2.6 41.6 3.5 91.6 4 2.7 41.9 4.2 90.0 5 2.7 59.0 4.9 91.7 6 2.9 41.1 3.5 91.5 7 3.0 42.8 3.8 91.1

　　由表6可見，三相流化床的除油率均在90%左右，因此將高效降解原油菌與高效處理構筑物組合能獲得良好的處理效果。?

5 結論

　　① 經篩選和誘變獲得的芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、假單胞菌屬等5株菌是高效降解原油菌，其對原油的適宜降解條件為廢水初始pH值為5.5～7.0、處理溫度為25～35℃、溶解氧為5.7～7.2mg/L。?
　　② 高效降解原油菌與三相流化床組合可使廢水中的原油含量由進口的44.4mg/L降至出口的4.0mg/L，平均去除率為91.0%，達到了排放標準。

參考文獻：

　　［1］杜連祥.工業微生物學實驗技術［M］.天津：天津科學技術出版社，1992.
　　［2］國家環境保護局.水和廢水監測分析方法［M］.北京：中國環境科學出版社 ，1989.
　　［3］K Chin Kee.Evaluation of treatment efficiency of processes for petroleum refinery wastewater［J］Water Science and Technology,1994,29(8):47-50.
　　［4］Kettunen Riitta H,Pulkkinen Esa M,Rintala Jukka A.Biological treament at low tem peratures of sulfur-rich phenols containing oil shale ash leachate［J］.Water Re search,1996,30(6):1305-1312.

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　　電　話：(010)69213295 13831691828?
　　收稿日期：2001-12-25