馬 軍， 邱立平， 馮 琦
( 哈爾濱工業大學市政環境工程學院，黑龍江哈爾濱1500 90)

　　 摘 要： 綜述了聚合酶鏈式反應(PCR技術)的原理、方法及其研究進展，介紹了PCR及其相關技術在水體微生物檢測中的優勢和應用研究現狀，分析了該技術在水體微生物檢測中存在的問題及解決方法。PCR技術的應用將極大地提高水體微生物檢測速度、靈敏度和準確度，對于評價水處理過程中細菌、病毒、病原原生生物等的去除效率也將具有重要意義。
　　關鍵詞： PCR； DNA； 水體微生物； 檢測
　　中圖分類號：X832
　　文獻標識碼：B
　　文章編號： 1000-4602(2002)01-0034-03

1 PCR技術及其發展

　　PCR技術最早于1985年由美國人類基因學會(ASHG)年會在DNA片段擴增工作的研究中得以描述，由此開始在各個相關領域得到了迅速而廣泛的研究，現已成為一個世界性的前沿課題。
　　PCR是一種具有選擇性的體外DNA或RNA擴增方法。通過選擇某一特定微生物物種的一段特異性基因區域(即所謂“目標序列”)進行體外擴增，再由凝膠電泳等DNA分析技術確定其種類及含量。PCR技術的特異性是由人工合成的引物DNA序列確定的。所謂引物是指與待擴增核酸 片段兩端互補的寡核苷酸，即ssDNA(單鏈DNA)。PCR反應包括目標DNA序列的加熱變性、引物退火復性和在DNA聚合酶作用下的引物延伸三個階段。其做法為：環境水樣中微生物經預處 理后取得DNA樣板，在變性溫度下DNA變性解旋；在復性溫度下兩引物分別與兩條DNA的兩端 互補性結合，此時引物的3′端相對，5′端相背，稱引物與模板的雜交；在延伸溫度和適當 的pH值及離子強度下，由TaqDNA聚合酶催化引物引導的DNA由5′端向3′端延伸，從而完成一個變性—復性—延伸的PCR循環。通過不斷的PCR循環，可以使擴增DNA產量呈上升指數， 達到體外擴增特定DNA序列的目的。
　　最先利用PCR技術擴增而出的DNA序列是人的β—球蛋白基因［1］，并在1987年6月首次臨床應用。有關DNA提取、引物設計、反應溫度、擴增產物的分析技術等方面的研究成果逐 漸增多，已相繼建立了套式PCR(nested PCR)、半巢式PCR(semi-nested PC R)、反向(逆轉錄)PCR(reverse transcriptase-mediated PCR)、競爭性PCR(competitive P CR)等技術方法。PCR技術在已進行的微生物檢測研究中充分顯示了其快速、靈敏的優點，如Niederhauser等人［2］利用PCR技術檢測食品中的單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytoge nes)只需32～56 h，而傳統方法為10d。

2 在水體微生物檢測中的應用

　　目前PCR技術應用于水體微生物檢測研究的重點是給水的微生物檢測，尤其是近年來引起人們廣泛關注的病原微生物，諸如軍團菌(Legionella pneumophila)、賈第蟲(Giardia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)及一些腸道病毒等的PCR檢測方法研究。研究的內容包括DNA物質提取方法的改進、樣品中PCR抑制物的去除、PCR方法的改進與比較、擴增產物的分析技術等。
2.1 供水衛生學安全檢測
　　最早的水體細菌學檢驗始于1885年，流行病學的證據表明［1］，在過去的60年中工業化國家由水媒病原微生物所引起的爆發性流行病發病率已有了明顯的下降，這其中供水的衛生學檢驗功不可沒。
　　與傳統方法相比，PCR方法不僅檢測時間短、靈敏度高，還可以檢出一些依靠培養法不能檢測的微生物種類。PCR方法已在糞便污染指示菌及病原細菌［3］、病毒［4］ 、軍團菌和病原原生生物［5～7］等的檢測中有了比較深入而廣泛的研究，取得了較好的應用成果。如Zehr等［8］利用PCR技術直接從海水DNA樣品中特異性地擴增一種目前常規方法無法培養的Trichodesmium thiebautii菌株的固氮基因(nif)片段。Catalan等［9、10］分別檢測了污水和飲用水中軍團菌污染情況。對于生物污染嚴重的污水中的軍團菌用常規的分離培養法不可能檢出，而用套式PCR方法則可極其準確地檢出，檢測時間僅為4h,而用培養法檢測飲用水中的軍團菌需7～10 d。Catalan等還進行了腸道病毒 的PCR方法檢測研究，發現PCR法不僅可將檢測時間從培養法的3～4周縮短到8h，還大大地提高了靈敏度和選擇性。Fricker等［1］報道的一種用于檢測病毒的PCR新方法可在24h內得到測定結果，并且極其靈敏。他們開創的一種基于PCR的E.coli.檢測方法可以在2 4 h內完成對99種不同的環境水樣檢測，取得了與標準方法100%吻合的檢測結果，該方法已列為泰晤士河的例行檢測項目。Hallier-Soulier等［5］利用免疫磁分離PCR技術 檢測飲用水中Cryptosporidium parvum卵囊蟲的靈敏度達到了可以在5～100 L水樣中檢出一個蟲體。Heiber等［11］利用與核酸探針技術結合的PCR方法檢測糞便污染指示菌，有效地排除了一些抑制物的干擾，可以對E.coli等進行快速測定。一些學者還進行了多個引物同時應用的嘗試［12］，以期提高檢測效率。近一時期，基于PCR技術的16SrD NA檢定技術等也在水體微生物檢測領域被廣泛研究［13］。
2.2 廢水生物處理過程的監測與評價
　　常規檢測方法受采樣及分析條件的影響極大，結果準確性差，檢測時間長，并且有些種類( 如厭氧菌)分離困難，而PCR技術不僅克服了這些缺點，還為一些生物參數應用于水處理工藝的自動控制提供了可能。由于水處理過程中生物氧化作用是由多菌種共同作用的結果，因此各不同菌群之間的相互作用至關重要。由PCR技術發展而帶動的基于多態性技術在微生物生態系的研究取得了迅速進展，如DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis)技術、RAPD(Randomly amplified polymorphic DNA)技術都可以檢測各種生物反應器中的微生物種群結構。Selvaratnam等人［14］用編碼苯酚單加氧酶dmpN基因的RT—PCR技術 來檢測處理廢水的SBR反應器中降解酚的假單胞菌。結果表明，RT—PCR方法不僅能檢測出微生物降解酚的能力，還能測量出dmpN基因的轉錄水平，從而確定該假單胞菌特殊的分解活性，而且發現在轉錄水平條件下，酚濃度與通氣時間之間存在正相關關系。Ferris等人［14］用DGGE分析16SrDNA基因的擴增產物來繪制一組微生物種群的16SrDNA基因圖譜。RA PD(randomly amplified polymorphic DNA)技術也是應用比較廣泛的一種以多態性引物來擴 增某些片段的技術。RAPD分析用于檢測含有混合微生物種群的各種微生物反應器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時間內微生物種群的變化以及比較小試和中試規模的反應器方面是有用的，但還不足以用來估測群落的生物多樣性。用RAPD分析檢測 實驗室規模的油性淤泥培養料中的細菌菌群發現，用油脂淤泥改良過的培養料比未經改良的更適合于不同的微生物種群生長。Vainio等人^［14］將從516種孤立的菌落中提取出的16SrDNA經PCR擴增后進行測序來檢測活性污泥中微生物種群的結構。這些組合技術的應用大大增強了對微生物的檢測和鑒定能力，從而為理論研究工藝優化及生物處理效率的提高提供了條件。
2.3 存在的問題及解決方法
　　① PCR反應能夠被自然界中一些物質所顯著抑制，例如胡敏酸、富里酸、某些離子及糖類 物質等可以干擾Taq聚合酶的作用。同樣，環境水樣在濃縮、保存和提純過程中可能從環境 及中間處理環節帶來一些潛在的PCR反應抑制劑，例如EDTA、十二烷基硫酸鈉和一些胍基化合物等，另外還可能有一 些共存物質可能抑制PCR反應。這些抑制劑一方面可能抑制PCR反應；另一方面還可能造成 假陽性結果。因此，研究環境樣品中待擴增DNA或RNA的提純技術以消除抑制物的影響［9、15］是十分重要的。對水體樣品的提純比其他環境水樣相對容易些，這也為PCR技術在水體檢驗中的廣泛應用提供了有利條件。
　　② 檢測對象的生物活性。由于DNA的檢測并不意味著必須使用活細胞，從理論上講任何可以提供核酸物質的樣品都可以進行PCR擴增，這就是說PCR技術不能區分活細胞和死細胞，尤其是在水體衛生學檢驗中不能確定所檢出的病毒粒子是否具有感染能力，這是一個待解決的問題。如果擴增mRNA的技術取得突破也許會對解決這個問題提供很大的幫助，這在一定程度上取決于使用什么樣的引物。Fricker等［1］認為rRNA擴增及現場雜交技術來鑒定細菌和原生生物活性的方法，其有效性尚待在環境樣品的實際檢驗中證明。
　　PCR技術的不足會逐漸得到改進，但全面將其作為標準方法來使用尚需做很多工作。

3 結語

　　PCR技術為水工業技術研究及評價提供了快速、方便的檢測手段，對于保障安全供水、促進廢水生物處理工藝研究有著重要意義。PCR技術具有快速、靈敏、準確和簡便等特點，有傳統方法無可比擬的優勢。PCR及其相關技術的研究應用和不斷推廣必將提高水體微生物的檢測水平，促進水工業的發展。

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