常紅1 胡建英1* 邵兵1,2 楊敏2
1.北京大學城市與環境學系，北京，100871；2.中國科學院生態環境研究中心

　　近年的研究表明許多化學物質干擾人類及野生動物的內分泌系統,導致男性精子數減少,野生生物生殖機能和生殖器官發育出現異常現象。在這類物質中,人工合成及自然雌激素是一類比較重要的化學物質[1]。
　　由于我國是當今世界上避孕藥生產和銷售量最大的國家之一，而合成雌激素是避孕藥的主要成分；同時，我國的城市污水處理率普遍較低，因此從污染水平看，我國存在來自人類，家畜的自然雌激素和人工合成激素的污染較其他發達國家高的污染特征。由于雌激素類物質在極低濃度條件下顯示出強的內分泌干擾作用，而且有可能和水體中殘留的其他類雌激素物質發生協同作用，因此這類物質對生態環境潛在的危害性是不可忽視的。
　　目前用于監測環境中痕量雌激素的方法是衍生-GC/MS法[2]。由于衍生-GC/MS法操作繁雜，衍生率變化大等原因，實際應用起來比較困難.Maria[3]等建立了幾種典型的雌激素的LC/MS分析法，但到目前為止僅僅停留在標準樣品的檢測，應用到環境中痕量雌激素分析還有待進一步的完善。
　　本研究選擇了在我國生產產量比較大的3種合成雌激素，己烷雌酚（DES）、戊酸雌二醇(EV)、炔雌醇(EE)；3種自然雌激素,雌二醇(E2)、雌酮(E1)和雌三醇(E3)和雙酚A(BPA)，建立了用于以環境調查的固相萃取(SPE)-LC-MS聯用方法。

1. 實驗部分

　　1.1儀器
　　Waters 2690 Separations Module-Miromass ZMD液質-聯用系統, SPS 24固相萃取（SPE）裝置（Varian公司）。
　　1.2試劑、標準品及材料
　　本試驗的對象物質的結構如圖-1所示。雌二醇、雌三醇、雌酮，雙酚A、己烷雌酚、戊酸雌二醇、炔雌醇，均來自日本和光公司；純水（電導率，18.1Ω.cm-1）；乙氰、甲醇都為HPLC級（Fisher公司）；StrataTMC-18-E 固相萃取柱（500mg/6ml）。
　　1.3樣品前處理
　　取500ml水樣，濾紙過濾后用固相萃取柱進行濃縮。柱活化條件：6ml 乙氰，6ml甲醇，6ml超純水。上樣速度：3-5ml/min。洗脫條件：10ml乙氰。洗脫液在微弱氮氣下吹干，用乙氰定容至0.5ml。
　　1.4 LC-MS分析條件
　　本文用Waters Xterra MS C18（2.1×150mm）色譜柱分離分析對象物質。流動相A：超純水，流動相B：乙氰。采用梯度淋洗，梯度條件：在15min內流動相B從10%線性變化到50%， 然后保持到25min不變，然后在5min內流動相B從50% 增加至100%,保持5min不變。
　　質譜條件：去溶劑氣流量500 l/h，去溶劑溫度400°C，錐孔氣流量100 l/h，離子源的溫度100°C，噴霧毛細管電壓2.0KV。

2. 結果與討論

　　2.1 質譜條件的優化
　　為了得到最大的靈敏度，首先，對可能影響質譜靈敏度的的各種條件進行了優化，發現離子源的錐孔電壓對靈敏度影響較大。圖-2為7種對象物質在不同錐孔電壓下的響應曲線。從圖可知，各對象物質在最大靈敏度響應時的錐孔電壓(V)有很大的不同，獲得最高靈敏度時的錐孔電壓分別為E1（50 ）、E2（60）、E3（60）、BPA（30）、EV（50）、HEXO（30）、EE（50）。
　　2.2 色譜分離及定量

表-1 7種物質的性質、回收率和檢測限 物質 分子量 logPow LC-MS
LOD(μg/l) 回收率(%) E1 270 3.69 0.4 87.6 E2 272 4.13 0.2 78.2 E3 288 2.94 6.2 73.1

　　如圖1和表1所示，對象物質具有非常相似的結構和物理性質。為了有效地分離具有相似性質的對象物質，本試驗采用了流動相組分梯度的方法。圖-3為7種化合物的標準混合物的LC-MS色譜圖。除E2和BPA以外,其他物質得到了很好的分離。E2和BPA的分離根據分子量的不同用MS分離后定量。各物質的定量采用外標法。結果表明各種物質的濃度-響應值具有較好的線形關系（r2>0.999）。
　　2.3 固相萃取的回收率
　　由于這幾種雌激素物質的濃度在環境中非常低，所以必須建立一個高效的濃縮方法。常用的固相萃取柱填料有C-18、高分子以及石墨化碳黑（GCB）等。考慮到低濃度測定時，盡可能減少雜質峰的影響，本文選用了吸附性相對較低的C-18作為濃縮用固相萃取柱,并對不同添加濃度條件下的回收效果進行了評價。圖-4表示標準添加濃度為0.18μg/l時的LC-MS色譜圖。各物質的回收率如表-1所示。E1、E2、BPA、DES的回收率都高于80%，EV的回收率偏低，為60%。從表的logPow看，造成EV回收率低的原因可能是由于它的極性較低，而沒有完全從固相柱上洗脫下來，還有待于進一步改善。
　　2.4 檢測限
　　這7種對象物質的儀器檢測限（S/N=3）如表-1所示。E1、E2、BPA具有較低的儀器檢測下限。考慮到方法的濃縮倍數和各物質的回收率，各物質的方法檢測限如表1所示。結果表明本方法可以測定環境中納克每升濃度的對象物質。

3．結論

　　本文建立了一種能夠同時檢測環境水平的合成和自然雌激素的SPE-LC-MS方法。今后，計劃利用此法檢測這類物質在環境中的濃度水平，研究它們的環境化學行為。

參考文獻：

　　[1] Purdom, C.E.；Hardiman, P.A.；Bye, B.J.；Eno, N. C.；Tyler, C.R.；Sumper, J. P. Chem. Ecol. 1994, 8, 275-285.
　　[2] D. Jahr, Chromatographia. 1998, 47, 49.
　　[3] Maria J. Lopez de Alda；Damia Barcelo. Journal of Chromatography A. 2000, 892, 391-406.

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國家杰出青年科學基金(49925103)和國家自然科學基金委員會創新研究群體科學基金(40024101)資助

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