李 峰1，呂錫武1，嚴 偉2
（1.東南大學 環境工程系，江蘇 南京 210096；2.加拿大康柯迪亞大學） 摘要：以聚乙烯醇為包埋劑，探索其制備固定化細胞小球的工藝過程，著重從小球顆粒的機械強度、傳質性能及微生物活性等三個方面來選擇其最適宜的包埋條件。最后，還對固定化細胞的保存進行了試驗研究。
關鍵詞：聚乙烯醇； 固定化細胞； 包埋劑； 廢水處理
中圖分類號：X703.5
文獻標識碼：A
文章編號：1000-4602(2000)12-0014-04 Study on Polyvinyl Alcohol (P V A) as Entrapping Agents for Immobilizing Microbial Cell
LI Feng1,LU Xi-wu1,YAN Wei2
(1.Depart.of Environ. Eng., Southeast Univ., Nanjing 210096,China;
2.Depart.ofMech.Eng.,ConcordiaUniv.,Montreal,Quebec,Canada,H3G1M8) Abstract： In this paper, the preparation of immobilized cells ware explored by choosing P V A as entrapping agents. The optimal conditions were chosen in terms of the mechanical stability, mass transfer, and bacteria activity of the cells. In addition, experiments on the preservation of the immobilized cells were done.
Keywords： polyvinyl alcohol (PVA); immobilized cells; entrapping agents; wastewater treatment 固定化細胞技術是60年代初發展起來的生物工程新技術，在廢水處理領域中具有處理效率高、裝置占地小、剩余污泥產量少等優點，從而成為近年來研究的熱點。目前細胞固定化方法［1］有載體結合法、交聯法和包埋法三種。在各種固定化方法中，尤其以利用高聚物在形成凝膠的過程中將微生物固定在其內部的包埋法優點更為突出。在包埋法固定化技術中，首先是選擇合適的包埋劑及包埋條件。適用于廢水處理的包埋劑應滿足：在固定化過程中，微生物活性喪失少；固定成球后，機械強度高，傳質性能好，性質穩定等。包埋劑主要有瓊脂、聚丙烯酰胺、海藻酸鈉、明膠、幾丁質及聚乙烯醇(簡稱PVA)等。針對廢水處理的實際情況，一般認為PVA是比較合適的包埋劑，但對其作為包埋劑形成固定化細胞的性能及適宜包埋條件的研究還不夠細致深入。針對上述情況，采用聚乙烯醇作為包埋劑，研究其包埋菌種的最適宜操作條件(包埋菌種取自鎖金村污水處理廠曝氣池活性污泥)。
影響固定化細胞制備的因素很多，主要有包埋劑、包泥量、交聯劑、交聯時間及小球粒徑等。由于固定化細胞應用于廢水處理中，需一定的強度及傳質性能(如受曝氣及機械攪拌的影響)，因此本試驗先考察包埋劑中其他添加劑、交聯劑對固定化細胞成球難易以及強度、傳質性能的影響，獲得固定化細胞制備的基本技術參數，然后以固定化細胞的CODCr去除率為主要指標，強度為輔助指標，采用正交試驗確定其適宜的包埋條件。 1 材料與方法 1.1 試劑
聚乙烯醇PVA(平均聚合度1750±50)、硼酸(分析純)、氯化鈣(分析純)、海藻酸鈉(化學純)、碳酸鈉(化學純)、氯化鈣(化學純)。
1.2 試驗方法
① 固定化細胞的制備。固定化細胞的制備流程見圖1。 
② CODCr去除效率的測定。在300mL人工合成的葡萄糖廢水中，投入包埋了與活性污泥法同等泥量(2g)的固定化微生物小球，靜態曝氣24h后測定CODCr值，與活性污泥法做比較。
③ 強度試驗。將固定化小球放入100mL注射器中，加一定的壓力，觀察小球的破損情況；或用手捏包埋好的固定化小球，以此來定性描述小球的強度。
④ 固定化小球傳質性能的測定。取數粒固定化小球投入盛有200mL自來水的錐形瓶中，滴加兩滴亞甲蘭液，定時觀察亞甲蘭進入各種粒徑小球的情況，以此為指標定性判斷固定化小球的傳質性能。 2 結果與討論 2.1 固定化細胞制備的基本技術參數
據文獻［2］報道，PVA—硼酸法包埋微生物形成的細胞小球受添加劑及交聯劑的影響較大，因此，選用海藻酸鈉作為添加劑，交聯劑則采用2%的CaCl2及Na2CO3，并分別進行了包埋試驗研究，試驗結果見表1。 表1 添加劑和交聯劑的影響| 試驗編號 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# | 6# | | 包埋劑 | 10%PVA | 10%PVA | 10%PVA | 10%PVA | 10%PVA | 10%PVA | | 添加劑 | 無 | 1%海藻酸鈉 | 2%海藻酸鈉 | 2%海藻酸鈉 | 0.5%海藻酸鈉 | 0.2%海藻酸鈉 | | 包泥量 | 1∶1 | 1∶1 | 1∶1 | 1∶1 | 1∶1 | 1∶1 | | 交聯劑 | 飽和硼酸 | 飽和硼酸 | 飽和硼酸 | 飽和硼酸滴加
2 % CaCl2、Na2CO3調pH=6.7 | 飽和硼酸滴加
2%CaCl2、Na2CO3調pH=6.7 | 飽和硼酸滴加
2%CaCl2、Na2CO3調
pH=6.7 | | 平均粒徑 | 約3 mm | 約3 mm | 約3 mm | 約3 mm | 約3 mm | 約3 mm | | 小球強度 | 較弱 | 一般 | 較強 | 強 | 強 | 強 | | 傳質性能 | 一般 | 一般 | 較好 | 好 | 好 | 好 | | 成球難易 | 一般 | 易 | 易 | 易 | 易 | 易 | 在PVA—硼酸法包埋微生物中投加少量海藻酸鈉，不僅容易成球，還可防止粘連現象；交聯劑中采用2%CaCl2和Na2CO3調pH至6.7，進行硬化處理，可使小球強度得到提高。從表1可發現，3#試驗小球的強度、傳質性能均屬上乘，但通過對3#小球進行靜態曝氣試驗，發現小球結構極不穩定，經過1d的連續曝氣后，添加劑海藻酸鈉發生析出，小球結構松散，并容易解體。于是，逐步減少海藻酸鈉的投加量，到6#試驗的海藻酸鈉投加量為0.2%時，基本沒有析出現象，并能維持較好的強度和傳質性能。因此，選用6#試驗條件作為固定化細胞的基本包埋條件。
2.2 固定化細胞最適宜包埋條件的選擇
在上述試驗的基礎上，采用正交試驗［3］確定最佳包埋條件，設計四因素三水平正交試驗表，各因素各水平的選擇是在參考有關研究［2、4、5］的基礎上擬定的。試驗因素有：包埋劑濃度(A)、濃縮污泥與包埋劑溶液的重量比(簡稱包泥量B， W/V)、交聯時間(C)及小球粒徑(D)，以固定化細胞的CODCr去除率為主要指標，強度為輔助指標。各因素因子水平取值見表2，各因子水平組合設計見表3，試驗結果見表4。 表2 正交試驗各因素因子水平的取值| 包埋劑 | 因子水平 | 因子 | | A(%) | B(W/V) | C(h) | D(mm) | | PVA | 1 | 7.5 | 1∶1 | 16 | 7 | | 2 | 10 | 2∶1 | 24 | 5 | | 3 | 12.5 | 1∶2 | 32 | 3 | 表3 正交試驗各因子水平組合設計| 因子代號 | 因子 | | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | | A | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | 3 | | B | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | | C | 1 | 2 | 3 | 2 | 3 | 1 | 3 | 1 | 2 | | D | 1 | 2 | 3 | 2 | 1 | 2 | 2 | 3 | 1 | 表4 正交試驗結果與分析| 序號 | 包埋劑濃 度(%) | 包泥量(W/V) | 交聯時
間(h) | 小球粒徑(mm) | 出水COD Cr(mg/L) | CODCr去除率(%) | | 1 | 7.5 | 1∶1 | 16 | 7 | 75.65 | 46.31 | | 2 | 7.5 | 2:1 | 24 | 5 | 62.18 | 55.87 | | 3 | 7.5 | 1∶2 | 32 | 3 | 76.68 | 45.58 | | 4 | 10 | 1∶1 | 24 | 3 | 55.14 | 60.87 | | 5 | 10 | 2∶1 | 32 | 7 | 76.34 | 45.82 | | 6 | 10 | 1∶2 | 16 | 5 | 79.17 | 43.81 | | 7 | 12.5 | 1∶1 | 32 | 5 | 73.24 | 48.02 | | 8 | 12.5 | 2∶1 | 16 | 3 | 81.25 | 42.33 | | 9 | 12.5 | 1∶2 | 24 | 7 | 69.43 | 50.72 | | K1 | 147.76 | 155.20 | 132.45 | 142.85 | | | | K2 | 150.50 | 144.02 | 167.46 | 147.70 | | | | K3 | 141.07 | 140.11 | 139.42 | 148.78 | | | | k1 | 49.25 | 51.73 | 44.15 | 47.62 | | | | k2 | 50.17 | 48.01 | 55.82 | 49.23 | | | | k3 | 47.02 | 46.70 | 46.47 | 49.59 | | | | R | 3.15 | 5.03 | 11.67 | 1.97 | | | 注 進水CODCr為140.9mg/L，同等泥量和同等操作
條件下未包埋菌出水CODCr為21.67mg/L，去除率為84.62%。 | 試驗結果表明，在成球范圍內，PVA濃度等三因子水平變化對強度影響不大。表4所列K值反映了對應因素在其他因素變化基本相同的條件下與CODCr去除率的關系，K值越大，說明在該試驗條件下該因素的水平越好，而每個因素最佳水平的組合，即為CODCr去除率最高的試驗條件。由表中數據可知，包埋劑PVA濃度為10%、包泥量為1∶1、包埋時間為24h、小球粒徑為3mm是最佳工藝組合。這個計算結果剛好與4#試驗的條件相同，試驗證明，在該組合條件下，CODCr去除率達到了60.87%的最高水平。級差及大小反映了因素變化時試驗的變化幅度，級差越大，就是該因素對指標影響越大，它就越重要。因此比較多因素的級差R，決定因素的主次關系為：  在這四因素中，交聯時間對CODCr去除率影響最大，為主要因素，小球粒徑影響較小，為次要因素，對次要因素常可根據實際情況選擇其他水平。
2.3 固定化細胞的保存試驗
盡管固定化細胞有諸多優點，但如果必須現場制作，則會給它的推廣應用帶來許多不利的影響。特別是對于某些特效降解菌，當出現事故(如原油泄漏)時，人們總是希望能直接投加固定化細胞而不需要進行長時間的馴化，因此就必須對固定化細胞進行適當的保存。試驗設計使用了四種保存條件：A、干燥室溫；B、冷藏(-4℃)；C、4℃合成廢水(CODCr200mg/L左右，其他成分按生活污水配制)浸泡；D、4℃蒸餾水浸泡。按上述選定的包埋條件將鎖金村污水處理廠曝氣池活性污泥制成PVA小球，經10d保存后，取四種保存條件下小球各4g，在300mL合成葡萄糖廢水中靜態連續曝氣，測定其CODCr降解變化。四種條件下CODCr去除率變化與曝氣時間的關系見圖2。 
經過保存和連續靜態曝氣后，各種保存條件下固定化細胞小球強度均有所降低，其中D(4℃蒸餾水浸泡)小球已解體。由圖2可知，固定化細胞小球經一段時間(10d)保存后，活力均有所下降，但經過靜態連續曝氣又可使活性逐步恢復，其中C(4℃合成廢水浸泡)小球活性恢復得最快，在曝氣不到1d后即可達到原有水平，表明細菌存活率較高，主要原因是在低溫條件下，即使細菌代謝活動極弱，也需要養料來維持生命活力，而A(干燥室溫)、D(4℃蒸餾水浸泡)均不能滿足這一要求，保存后活力大為下降；B(冷藏)則是在冷凍條件下，細菌處于休眠狀態，存活率較高，但需要較長時間(＞1d)來使其恢復活性。經過靜態連續曝氣后，各種保存條件下固定化細胞小球的去除率均可得以恢復，有的已經超過保存前水平(冷藏和4 ℃合成廢水浸泡)，表明包埋固定后暫時失活的細菌已馴化恢復活性或繁殖出更多高活性菌體，導致去除率提高。綜上所述，四種保存條件中，以合成廢水浸泡為最優，其次為冷藏(-4℃)、干燥室溫和4℃蒸餾水浸泡。 3 結論 ① 聚乙烯醇(P V A)作為固定化細胞包埋劑的適宜包埋條件為：PVA濃度10%、包泥量1∶1、包埋時間24h、小球粒徑3mm、投加2%的添加劑海藻酸鈉，交聯劑飽和硼酸用2%CaCl2和Na2CO3調pH至6.7進行硬化處理，包埋固定的小球具有較高的細菌活性，較好的強度及傳質性能。
② 在選定的四因素的各個因子范圍內，影響固定化細胞性能的主次關系依次為：交聯時間、包泥量、PVA濃度、小球粒徑。
③ 固定化細胞的四種保存條件中，優劣順序依次為合成廢水浸泡(4℃)、冷藏(-4℃)、室溫干燥和蒸餾水浸泡(4℃)。 參考文獻：
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［3］欒軍.現代試驗設計優化方法［M］.上海：上海交通大學出版社，1994.
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作者簡介：李峰(1974-)，男，江西玉山人，南京市市政設計研究院工程師，碩士，研究方向：水污染控制。
電話：(025)7717717×3014
E-mail:ffli74@263.net
收稿日期：2000-07-19 | 
