尹軍
吉林建筑工程學院

　　摘要：在大量研究工作基礎上，對檢測消化污泥脫氫酶活性所涉及的內(nèi)源代謝脫氫酶活性與基質(zhì)代謝脫氫酶活性的區(qū)別、投加基質(zhì)、樣品前處理、酶反應終止劑、三苯基甲月替(TF)的萃取劑及其濃度問題進行了探討。
　　關鍵詞：脫氫酶活性；測定；消化污泥
　　中圖分類號：X703
　　文獻標識碼：C
　　文章編號：1000-4602(2000)10-0047-03

　　脫氫酶是生物細胞內(nèi)催化有機物氧化(脫氫)，并將其傳遞給最終電子受體的氧化還原酶，這類酶的活性可以通過加入人工受氫體的辦法進行檢測。通常用于檢測脫氫酶活性的人工受氫體包括TTC、刃天青、亞甲基藍以及INT等，其中研究和應用最多的是TTC試驗。
　　TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)是最早被人們發(fā)現(xiàn)的人工受氫體，它首先是由Kuhu和Jerchel用于生化分析實驗中的。自從Bucksteeg和Thiele提出TTC—試驗以來，國外一些學者早在60年代就已將這一生化分析技術逐步應用到廢水生物處理領域。70年代Klapwijk等和Ryssov-Nielsen在廢水處理活性污泥法的研究中，都曾對TTC—試驗作過改進。目前，國內(nèi)有關文獻資料所介紹的TTC—脫氫酶活性測定法，多與Klapwijk所提出的TTC—試驗的改進方法有關。
　　80年代以來，國內(nèi)外雖然也有利用TTC—試驗進行活性污泥和厭氧消化污泥生化活性分析的報道，但由于TTC—試驗中高溫(90 ℃)萃取嚴重影響分析結果的準確度，致使該項生化分析技術的推廣應用受到限制。為了建立穩(wěn)定可靠、簡便易行的TTC—脫氫酶活性測定方法，以便使TTC—脫氫酶活性測定技術在環(huán)境監(jiān)測，特別是在水處理技術領域得到普遍應用，對檢測好氧消化污泥脫氫酶活性所涉及的內(nèi)源代謝脫氫酶活性與基質(zhì)代謝脫氫酶活性的區(qū)別、投加基質(zhì)、樣品前處理、酶反應終止劑、三苯基甲月替的萃取劑及其濃度等問題進行若干探討與分析。

　　1 內(nèi)源代謝與基質(zhì)代謝脫氫酶活性的區(qū)別

　　脫氫酶活性測定屬于生物化學分析技術范疇，其實驗過程設計和實驗條件的選擇，都應從生物學原理出發(fā)以及注意到檢測樣品的生物學特性。例如，消化污泥的生物學特性不同于活性污泥，從微生物呼吸類型方面看，其微生物維持生命活動的能量來源于細胞組成物質(zhì)的氧化分解，即所謂內(nèi)源代謝(Endogenous Metabolism)，而活性污泥微生物維持生命活動的能量來源于細胞內(nèi)營養(yǎng)基質(zhì)的氧化分解，即基質(zhì)代謝(Substrats Metabolism)。另外，內(nèi)源代謝過程總是伴隨著不可生物降解物的積累和衰老細胞的溶解及其胞質(zhì)釋放，這些代謝活動的副產(chǎn)物及其殘存的細胞碎片，使得污泥體系內(nèi)各種成分更為復雜，而活性污泥在代謝活動過程中則無明顯的上述情況。因此，消化污泥脫氫酶活性測定與活性污泥脫氫酶活性測定的實驗過程及其條件必然有以下明顯差別：①消化污泥樣品前處理主要目的是去除內(nèi)源代謝積累的副產(chǎn)物和細胞溶解物，而活性污泥樣品前處理主要目的是去除混合液中的復合基質(zhì)；②消化污泥樣品培養(yǎng)在不加外源性基質(zhì)條件下進行，而活性污泥樣品培養(yǎng)則往往要加入人工配制的單一基質(zhì)或復合基質(zhì)；③消化污泥內(nèi)源代謝速度緩慢，因此樣品培養(yǎng)時間較長，而活性污泥基質(zhì)代謝速度較快，樣品培養(yǎng)時間較短；④消化污泥樣品成分復雜，因此在選擇酶反應終止劑時，需要考慮終止劑能否與樣品中細胞殘片或某種生物大分子發(fā)生顏色反應干擾比色分析的問題，而在選擇活性污泥酶反應終止劑時，則無需注意此類問題。

　　2 測定中是否另加基質(zhì)的問題

　　Bucksleeg和Thiele在測定活性污泥脫氫酶活性時，并沒有加入有機基質(zhì)，而Lenhard等人卻在測定活性污泥脫氫酶活性時，向培養(yǎng)體系內(nèi)加入了TTC—葡萄糖復合試劑。Altman對四唑鹽作用原理和特殊脫氫酶活性應用方面進行了述評，認為TTC是唯一的一種被用來測定廢水污泥普通脫氫酶活性的物質(zhì)，一些研究者在恒溫培養(yǎng)的樣品中加入葡萄糖或乳酸鹽等基質(zhì)，實際上已經(jīng)使測定過程特殊化了。例如，高濃度乳酸鹽的加入，則意味著測定的是乳酸脫氫酶活性，而不是一般脫氫酶活性。Klapwijk等認為，樣品中缺乏有機基質(zhì)時，所測得的是內(nèi)源呼吸的脫氫酶活性，而加入基質(zhì)時，可測得最大基質(zhì)呼吸的脫氫酶活性，基質(zhì)的選擇應該是活性污泥法污水處理廠進水的主要成分之一。他還用單一基質(zhì)(如醋酸鈉、乳酸鈣、葡萄糖)和“混合基質(zhì)”(含尿素、明膠、可溶性淀粉等)進行對比試驗，結果證明乳酸鈣是試驗中最佳單一基質(zhì)。筆者也曾對乳酸鈣在脫氫酶活性測定中的作用問題進行了考察，發(fā)現(xiàn)加入乳酸鈣比不加乳酸鈣的測定值增加1.5～2.5倍。因此，在研究基質(zhì)代謝速率及其與脫氫酶活性關系時，可以選用4.6%乳酸鈣作為有機基質(zhì)，而在研究活性生物量或消化污泥生化活性時，則不必外加基質(zhì)。

　　3 測定樣品的前處理

　　Klapwijk的方法沒有對污泥樣品前處理問題提出明確的要求；Ryssov Nielsen采用10%(pH＝7.5)磷酸鹽緩沖液對活性污泥進行洗滌；日本學者瀧田久憲在INT—脫氫酶活性測定時，曾用BOD稀釋水反復洗滌活性污泥三遍，認為檢測經(jīng)洗滌后污泥樣品的脫氫酶活性為內(nèi)源性脫氫酶活性；國內(nèi)有些學者則主張用生理鹽水處理污泥樣品，我們研究發(fā)現(xiàn)用純水洗滌污泥樣品測定脫氫酶活性的效果較好。通過純水洗滌污泥樣品，一方面可去除消化污泥中殘存的基質(zhì)和可溶性的細胞溶解物，有利于內(nèi)源性脫氫酶活性的顯現(xiàn)，另一方面能夠調(diào)節(jié)污泥樣品的pH，有利于TTC還原為甲月替(TF)。

　　4 酶反應終止劑的選擇

　　Lenhard和Jones等曾采用乙醇和丁醇終止樣品污泥的酶反應。Klapwijk等和國內(nèi)一些學者均主張用濃硫酸終止酶反應，這是為了避免丁醇受熱易蒸發(fā)的問題，并發(fā)現(xiàn)向樣品中加1滴硫酸，便可立即停止酶反應，同時使污泥變得完全無色。另外，Ryssov-Nielsen在終止活性污泥酶反應時采用了物理方法，由于用硫酸來終止酶反應會使顯色液褪色，背景值增大，特別是可使污泥齡較長的樣品出現(xiàn)茶色反應，使空白值與樣品值發(fā)生逆轉，這種反常情況的出現(xiàn)可能與消化污泥內(nèi)源代謝的自身特性有關。因此，我們通過實驗比較了幾種有機化合物終止酶反應的效果。實驗表明，采用與培養(yǎng)液等體積的丙酮終止酶反應效果很理想，從未出現(xiàn)過像用硫酸終止酶反應的不良效果。但是需注意的問題是，如果脫氫酶活性檢測中酶反應的終止與萃取步驟合并進行，那么采用丙酮終止酶反應是完全可以的，然而實際上要突破高溫萃取測定結果不穩(wěn)定這一技術難關，就不能將酶反應終止與萃取合并進行。正是為了這個目的，我們又比較了丙酮、乙醇與甲醇在消化污泥脫氫酶反應終止方面的作用效果，發(fā)現(xiàn)采用占培養(yǎng)液體積1/10的甲醛終止酶反應效果顯著優(yōu)于乙醇，但從空白值大小方面看，甲醛往往略大于丙酮，且在污泥濃度很高時，空白對照中還有程度不同的黃色素。由于甲醛對酶反應終止作用迅速，試劑用量少，因此選用甲醛作為酶反應終止劑是合適的。

　　5 萃取劑的選擇

　　國外研究者曾采用過的萃取劑有甲醇、乙醇、丙醇，Klwpwijk等則選用丁醇作為萃取劑。國內(nèi)學者陳頌原發(fā)現(xiàn)，丙酮和甲醛萃取TF的效果優(yōu)于乙醇。我們的對比實驗表明，丙酮不但萃取TF的效果優(yōu)于甲醇、乙醇、異丙醇，而且萃取液顏色相當穩(wěn)定，這可能與丙酮自身化學特性有關。據(jù)資料介紹，丙酮具有選擇性溶解某些有機物的特性，且在水溶液中能夠抑制物質(zhì)離解。因此認為，丙酮應作為脫氫酶活性測定中TF萃取分離的首選試劑。
　　到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有人提出或研究有關萃取劑濃度對萃取效果影響的問題。在Klapwijk等提出TTC—試驗改進方法以后，國內(nèi)一些文獻資料幾乎都是把TTC—試驗中TF萃取溫度定為90 ℃。這里實際上忽略了萃取濃度問題，操作上大都在酶反應終止劑加入的同時，立刻加入與樣品培養(yǎng)液等體積的萃取劑進行90 ℃高溫萃取，這樣相當于萃取劑被稀釋1倍。采用不同濃度丙酮水溶液于37 ℃條件下萃取消化污泥樣品TF的結果表明，TF萃取效果受丙酮濃度影響，但并非100%丙酮萃取效果最佳。在丙酮濃度分別為100%、80%、60%、40%、20%的幾組對比實驗中，TF的最大測定值均發(fā)生在80%丙酮濃度條件下，60%丙酮萃取TF的測定值僅為最大測定值的58.36%。這個發(fā)現(xiàn)很重要，既為提高TTC—試驗中TF檢出量找到一種可行的技術途徑，也為本項研究獲得由高溫萃取為常溫萃取的突破性進展打下了基礎。
　　在以往的TTC—試驗中，Ryssov-Nielsen曾用溶菌酶破壞細胞壁的辦法提高萃取效率。然而，其他學者為什么要采取高溫條件下萃取TF呢?按照傳統(tǒng)的觀點來看，無非是說高溫條件可以破壞細胞結構，改進細胞的透性，以利于萃取劑對TF結晶發(fā)生溶解作用。我們認為，除上述原因以外，高溫條件實際上就是為了彌補萃取劑濃度不適，提高TF萃取能力不足而采取的強化措施。從這個觀點上看，我們完全可以采取選擇最佳萃取劑及其最適濃度的辦法，將原有TTC—試驗中高溫萃取操作改進為常溫萃取。按照這種設想，我們將終止酶反應后的樣品培養(yǎng)液進行離心，棄去上清液，然后用丙酮于37 ℃條件下萃取TF，并與原有的TTC—試驗進行對比，結果是前者的測定值高于后者，證明常溫萃取TF是可行的。
　　在TTC—試驗中，以常溫(37 ℃)萃取TF代替高溫萃取，是脫氫酶活性測定研究中的一項重大突破，這不但有利于提高脫氫酶活性檢測分析方法的可靠性，而且必將會對脫氫酶活性測定這一生化分析技術的廣泛應用起到積極的推動作用。

　　參考文獻：
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　　［3］周春生，尹軍.…［J］.環(huán)境科學學報，1996，16(4)：400-405.

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　　收稿日期：2000-04-11